Estudo da interferência do anticoagulante EDTA nos analitos do hemograma, relacionados ao tempo pós coleta.

Heloisa Helena Arantes Gallo da Rocha; médica hematologista; Fellow da International Society of Hematology, Membro da American Society of Hematology, Membro do Colégio Brasileiro de Hematologia; Membro da Sociedade Brasileira de Hematologia;

José Viegas; biólogo; Supervisor da Unidade Botafogo de Emergência do Laboratório Diagnósticos da América NTO/Rio Marca Lâmina.

Silvana Marcharett; bióloga, funcionária da Unidade Botafogo de Emergência do Laboratório Diagnósticos da América, Marca Lâmina NTO/Rio.

Rubem Menna Barreto; estudante de biologia; estagiário do Setor de Hematologia do Laboratório Diagnósticos da América/NTO Rio. Marca Lâmina.

Endereço para Correspondência: Rua Francisco Otaviano 23; Bl. 1 /403- Rio de Janeiro; CEP 22080- 040.

Tel: 21- 22879604

FAX- 21- 22478273

 

Gallo da Rocha,HH; Viegas,J, Marcharett, S, Mena Barreto R: Setor de Hematologia do Laboratório Diagnósticos da América/ Marca Lâmina/NTO Rio de Janeiro; RJ.28/02/2001.

 

Resumo:

A partir da necessidade cada vez maior que se impõe aos Laboratórios procederem coleta de sangue e remeterem ao Laboratório de Hematologia em tempos que variam até de 12 horas após a coleta e da realização da leitura das lâminas somente de hemogramas anormais, resolvemos observar as alterações sofridas pelas células de acordo com o tempo de exposição ao anticoagulante EDTA. 

As análises foram feitas logo após a chegada dos tubos de hemogramas normais ao  Setor (cerca de 30 minutos após a coleta)- que foi considerada hora zero e depois após 2,4,6,8,10,12 e 24  horas(dos mesmos pacientes da hora zero) .

O contador automatizado de células do hemograma utilizado  o Sysmex NE 800  que faz um estudo completo do hemograma, incluindo a contagem diferencial de leucócitos usando técnicas ópticas e por impedância.

Foi feito um estudo paralelo dos dados dos laudos das lâminas feitas pelos citologistas nos mesmos horários do aparelho e comparamos os resultados obtidos.

Concluímos 1.  hemogramas feitos em postos distantes podem ser feitos com precisão pelo analisador automático (até 8 horas se for hemograma normal e até 6 horas se não for hemograma normal ).

2. se houver alarmes de grumos plaquetários com trombocitopenia  devido ao anticoagulante EDTA,  o paciente deve ter seu sangue coletado dentro do Setor de Hematologia, para que suas plaquetas não tenham tempo de sofrer a ação do EDTA.

3. nos casos de solicitação de estudo semiológico do sangue periférico é necessário que se faça a lâmina no ato da coleta.

 

Summary

Automated blood cell analyser have been evolving since the late 1960’s and the instruments are now available of analysing blood samples with accuracy and precision.

In order to have our own experience in spite of the instruction manual, and to become aware about the modifications suffered by the different cells in contact with the anticoagulant (EDTA) thinking about time exposition we decided to have fifteen  to have fifteen normal blood samples to be processed at different time intervals:

Zero, 2, 6, 8, 10, 12 and 24 hours for all parameters of blood counting. At the same time we studied the slides obtained at those intervals, to establish the cellular modifications observed by us.

We conclude that normal blood samples can be processed until 24 hours after the venipuncture.

On the contrary, the anormal samples (generally the urgent ones) must be processed in 8 to 12 hours.

If it is important to have the cytological platelets analyses the slides must be done at the time of the venipuncure.

 

Introdução:

Os analisadores automatizados tem uma performance muito precisa com relação aos diferentes analitos do hemograma.

Foi feito um estudo no qual comparamos as leituras de hemogramas normais lançados por um analisador (Sysmex) com as leituras feitas pelos citologistas do Setor de Hematologia e o resultado não apresentou diferenças estatisticamente significativas (observações não publicadas).

O objetivo desse estudo foi de verificar as diferentes variações dos analitos do hemograma em função do tempo de exposição ao anticoagulante EDTA. As leituras de lâmina foram feitas pelo aparelho e pelos citologistas afim de comparação dos laudos obtidos dos dois grupos

Materiais e Métodos:

As amostras foram obtidas de duas fontes:  Setor de Hematologia e  Unidade Botafogo de Emergência do Laboratório Diagnósticos da América , Marca Lâmina/ NTO Rio.

15 amostras de pacientes foram estudadas no mês de janeiro de 2001. Os analitos estudados foram os seguintes:

1-  Contagem de leucócitos (WBC)

2-  Percentagem de neutrófilos (NEUT)

3-  Percentagem de monócitos (MONO)

4-  Percentagem de eosinófilos (EOS)

5-  Percentagem de basófilos (BASO)

6-  Contagem de hemácias (RBC)

7-  Dosagem de hemoglobina (HGB)

8-  Valor do hematócrito (HCT)

9-  Volume globular médio (VCM)

10-    Hemoglobina globular média (HCM)

11-    Concentração de hemoglobina globular média (CHCM)

12-    RDW- índice de anisocitose

13-    Contagem de plaquetas (PLT)

 

O analisador foi o Sysmex, NE 800(TOA Medical Eletronics, Kobe, Japão). Os citologistas foram os autores desse trabalho.

Todas as amostras coletadas vieram do Setor de Coleta do Laboratório Diagnósticos da América, Marca Lâmina /NTO Rio, em frascos a vácuo com EDTA,

As análises foram feitas logo após a chegada no Setor (cerca de 30 minutos após a coleta)- que foi considerada hora zero e depois após 2,4,6,8,10,12 e 24  horas .

O Sysmex faz um estudo completo incluindo a contagem diferencial de leucócitos usando técnicas ópticas e por impedância.

Os estudos de reprodutibilidade, linearidade, estabilidade de calibração são feitos diariamente antes de se começar a rotina.

Estatística utilizada:

1.  Análise de regressão: Determina a relação entre duas variáveis.

2.  ANOVA (Análise da Variância) com o  valor F. O nível de significância quando for igual ou menor que 0,05 (p-value), indica  correlação entre as duas variáveis.

3.  Foi feito o Teste t para comparação entre dois grupos de resultados, que dá a diferença de média entre duas amostras e considera-se significativo quando o p value é igual ou menor que 0,05. Se isso não ocorre é porque existe uma real diferença entre as médias ou então erro amostral (amostra pequena).

Resultados:

Como exemplo, abaixo colocamos como foram analisados os dados fornecidos pelo hemograma (planilha Excell) :

 

SAM201 – tempo em horas.

0

2

4

6

8

10

12

WBC

5,71

5,72

5,42

5,48

5,54

5,68

5,5

NEUT

60,1

57,3

58,5

57,2

57,3

56,1

56,8

LINF

25,2

26,2

25,6

25,2

23,6

24,5

24,9

MONO

11,2

12,2

12,4

13

14,8

14,8

14,2

EOS

3

3,8

3,1

3,5

3,4

3,7

3,6

BASO

0,5

0,5

0,4

1,1

0,9

0,9

0,5

RBC

3,51

3,48

3,51

3,53

3,54

3,49

3,49

HGB

11,9

11,9

11,9

11,9

11,9

11,9

12

HCT

35,8

36

36,2

36,3

36,5

36

36,1

VCM

102

103,4

103,1

102,8

103,1

103,2

103,4

HCM

33,9

34,2

33,9

33,7

33,6

34,1

34,4

CHCM

33,2

33,1

32,9

32,8

32,6

33,1

33,2

RDW

14,6

14,5

14,8

14,9

14,7

14,8

15,2

PLT

150

150

150

150

150

150

150

VPM

10,2

9,8

10,3

10,4

10,4

10,5

10,4

 

 

 

 

 

 

 

 

Resultados:

A Análise de Regressão feita em todos os analitos mostrou-se significativa com o valor de p < 0,05.

Dessa forma aceita-se a hipótese da influência do tempo de exposição afetando o hemograma como um todo.

O teste t de Duas Amostras Em Par Para Média mostrou:

Entre 0 e 2 hs: p=0.7

Entre 0 e 4 hs: p=0.63

Entre 0 e 6 hs: p=0.79

Entre 0 e 8 hs: p=0.84

Entre 0 e 10 hs: p=0.7

Entre 0 e 12 hs: p=0.53

Entre 0 e 24 hs: p=0.62

 

Quando se compara a partir das 4 horas de exposição ao EDTA:

Entre 4 e 6 hs: p=0.45

Entre 4 e 10 hs: p=0.84

Entre 4 e 12 hs: p=0.56

Entre 4 e 24 hs: p=0.62

 

Com este estudo podemos concluir que as diferenças entre os diversos tempos não foram significativas.

E assim sucessivamente os 15 hemogramas foram plotados e os analitos estudados e comparados estatisticamente um a um.

Com este estudo podemos concluir que as diferenças entre os diversos tempos não foram significativas.

Observações feitas pela análise das lâminas de hemogramas nos diferentes períodos de tempo de exposição ao EDTA:

Quanta à analise da lâmina nos diferentes tempos de exposição ao EDTA verificou-se que em cerca de 10% dos casos, a contagem de bastões teve um aumento de 5 a 19%, a partir de 6 horas da coleta, com uma média de 8%.Em 20% dos casos houve alarme de blastos e/ ou linfócitos atípicos após 8 a 24 horas da coleta.

Em 80% dos casos não houve alarme de atipias de linfócitos independente do tempo de coleta porém após da Sexta hora quase todas as lâminas mostraram atipias linfocitárias com citoplasmas ameboides à semelhança de células de Downey. Frisamos que o contador não emitiu  alarme de atipias linfocitárias nessa mesma hora e que na lâmina inicial, feita na hora zero não havia presença de atipias linfocitárias.

Em cerca de 20% das lâminas observou-se granulações tóxicas nos neutrófilos a partir de 12 horas de exposição dos neutrófilos ao EDTA.

Em alguns casos observamos células em apoptose somente após 12 horas da exposição.

Em semiologia de lâminas de pacientes com mononucleose, mielodisplasia,  em tratamentos quimioterápicos ou pós transplante de medula óssea , podemos observar com maior freqüência células em apoptose, no primeiro caso mononucleose, de células apoptóicas linfóides e nos outros casos, células mielóides em apoptose. Até doze horas de exposição  ao EDTA não ocorre apoptose de células linfoides ou mielóides normais, somente após 12 horas após a exposição.

 

Discussão:

 

Esse estudo demonstrou que os resultados dos diversos parâmetros do hemograma se feitos as 2, 4, 6, 8, 10, 12 ou 24 horas após a coleta, deixando o sangue total em contato com o anticoagulante EDTA durante todos esses tempos não afeta de maneira clinicamente importante o resultado emitido pelo Analisador Automático.

 

É interessante ressaltar que quanto à análise semiótica das células feita pelo hematologista/citologista, muito se perde com as lâminas coradas a partir de um tubo de sangue com EDTA(2). Os fatores mais importantes que foram notados nesse estudo em comparação com os dados obtidos pelo Analisador automático é que o mesmo consegue determinar mais acuradamente os diferentes tipos de células, mesmo edemaciadas ou alteradas pelo EDTA, coisa que fica difícil para o olho humano avaliar, por exemplo, uma lâmina retirada de um tubo de EDTA de 24 horas- notamos alterações nos linfócitos, que ficam com atipias, as plaquetas maiores e soltas e com comportamento anormal, e as granulações tóxicas nos neutrófilos ficam bem mais evidentes.

Sabe-se também que as alterações nas plaquetas começam após 15 minutos de exposição com EDTA e depois se mantém de uma maneira praticamente constante( 1).

O estudo feito com a Análise de Regressão mostrou que havia correlação entre o tempo de exposição do sangue e os resultados de todos os analitos estudados.

O estudo comparativo não foi consistente com o estudo da Análise de Regressão desses mesmos itens já que o  Teste t (p value) foi maior que o nível de significância, levando a aceitar a hipótese nula, ou seja o fator tempo de exposição ao EDTA não influenciou nos resultados dos analitos emitidos pelo aparelho; os laudos emitidos pelos citologistas não devem ser procedentes de lâminas distendidas  em um tempo maior que 6 horas após a coleta.

 

 

Conclusão:

·         O estudo da Análise da Regressão mostrou-se incompatível com os dados obtidos pelo Teste t devido a um erro amostral (amostra pequena).

·         Os hemogramas feitos em postos distantes poderão ser feitos com precisão pelo Analisador automático (até 24 horas se for hemograma normal, até 6 horas se  for hemograma anormal, pois nesses casos os laudos são dados pelos citologistas ). Em virtude do flebotomista não saber se o sangue que está coletando dará resultado normal ou anormal, é importante que o sangue chegue ao Setor de Hematologiaantes de pelo menos 6 horas após a coleta

·         Se o paciente apresentar grumos plaquetários com trombocitopenia  devido ao anticoagulante EDTA e o aparelho lançar um aviso (clumps) o paciente deve ter seu sangue coletado dentro do Setor de Hematologia, para que suas plaquetas não tenham tempo de sofrer a ação do EDTA.

·         Nos casos de solicitação de estudo semiológico do sangue periférico é necessário que se faça a lâmina no ato da coleta.

 

 

Referências Bibliográficas:

 

1.  Brummitt, DR Barker, HF: The determination of a reference range for new platelets parameters produced by the Bayer ADVIA 120 full blood count analyser;Blackwell Science Ltda. Clin.Lab.Haem: 22, 103- 107;2000.

2.  PattersonK. Platelets parameters generated by automated blood counters. CME Bulletin Haematology, 1: 13- 16;1997.